急性毒性

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急性经口毒性试验优化替代方法的比较

发表于 2016-08-29 责任编辑:陈志杰
摘要: 以死亡为终点的LD50一直以来都是经典的急性毒性试验的检测指标,由于试验所需动物数量大、动物遭受严重痛苦,以及可提供的毒性作用信息有限等不足一直备受质疑。
步犁1,2,程树军1
(1.广东出入境检验检疫技术中心食品实验室, 广东 广州 510623; 2.华代体外科学研究所,广州,510670 )
 
    以死亡为终点的LD50一直以来都是经典的急性毒性试验的检测指标,由于试验所需动物数量大、动物遭受严重痛苦,以及可提供的毒性作用信息有限等不足一直备受质疑。随着3R原则的运用和科学技术的发展,经典的LD50方法已于2002年被OECD废止,取而代之以3种优化方法:固定剂量程序法(FDP),上下程序法(UDP)和急性毒性分类法(ATC)。如果辅助理化特性分析、定量结构活性关系(QSAR)分析和人类细胞急性毒性预测法,不仅可大幅度减少急性毒性所需动物数量,而且可提供毒性作用的机制方面的信息。目前在欧美等国家以死亡为终点的试验已被所有法规废除,替代方法已成为强制性的方法。3项优化方法各有其特点及适用范围,本文旨在比较三种替代方法的异同点,为实验方法的选择提供参考。
 
一、3种优化方法的基本原理及特点
1.固定剂量法
固定剂量法(fixed dose procedure,FDP)于1984年最早由英国毒理学会提出,它不以动物死亡作为实验终点,而是以毒性发展的临床体征的观察作为终点,对化学品急性毒性进行分类。OECD于1992年采用了FDP,欧盟指令67/548/EEC附录V列为B.1bis,OECD于2001年作为指南TG 420。2008年我国采用该方法为国家标准。通常采用经典LD50试验平均每个化合物需用大鼠24.2只,固定剂量法平均用大鼠14.8只,明显比前者少。
其原理是固定5、50、300、2000mg/kg四个剂量(必要时可考虑增加5000mg/kg剂量组),依次使用同一性别的动物(通常为雌性)经口染毒。根据预实验结果,确定会发生毒性反应但不产生严重的毒性反应或死亡的剂量作为起始剂量进行试验,再根据观察的结果调整毒性剂量,当出现以下情况时终止试验[1]:1)当出现明显的毒性反应或已确认不多于一只动物死亡;2)最高剂量未出现毒性反应;3)最低剂量动物出现死亡。以初始剂量为50mg/kg为例,5只实验动物
 (包括预试验1只),如果死亡数≥2只,则再选择一组动物给予5mg/kg的受试物;如果≥1只动物具有明显毒性,或1只死亡,则将该受试物按GHS分类为3类物质;如表现为无毒性,则再选择一组动物给予300mg/kg的受试物。
FDP不能精确估计LD50的值和LD50的置信限,但是可以粗略的估计LD50的范围。同样,对于死亡剂量反应曲线的斜率及其置信限也无法估计。因为FDP是根据毒性反应的症状观察进行分类,故无法绘制LD50的剂量反应曲线,但是在一些验证和对比试验中发现FDP试验中所观察到的一些临床表现与LD50经典试验观察到的表现不同[2-5],只在少数情况下这些不同有意义。有文献报道使用统计学描述FDP时发现开始剂量的设定可以影响物质的毒性分类[6]
2.急性毒性分类法
急性毒性分类法(acute toxic class method,ATC)由Sumiey于1990年提出,用于危害评估危害分类以及危险度评价,它是以动物死亡作为实验终点的分阶段试验法[1]。OECD于1996年采用ATC,2001年更新列为指南TG 423,欧盟指令67/548/EEC附录V列为B.1tris。与经典急性毒性试验法相比,采用ATC法仅需2-4步即可判定急性毒性分类,所用大鼠不超过12只,有效地减少了动物的使用量。
其基本原理是实验分为若干个阶段,每阶段使用3只实验动物,最多使用6只动物。已设计有四个固定的剂量(5、50、300、2000 mg/kg),选定一个初始剂量进行实验,根据实验结果(死亡的或濒死的动物数量)来决定是否进行下一步实验或者终止试验。有3 种可能的结局: (1)无需进一步试验即可分级;(2)同一剂量水平再做3只动物;(3)在高一级或低一级剂量水平另做3只动物。
ATC不能用以精确估计LD50的值,但是,LD50的值可以根据提供的数据使用最大相似法进行计算。该方法同样也适用于对LD50的置信限,死亡剂量反应曲线及其置信限的估计。分类法能够发展并成为监管机构认可的方法一方面是因为它有较高的正确率,另一方面则是它的操作在实际应用中足够简便。有文献报道[7]:ATC对于物质的分类于依赖剂量水平的应用,每批剂量的动物使用数和决定实验应以高或底剂量的标准等三个方面。
3.上下增减剂量法
上下增减剂量法(Up-and-Down Procedure, UDP)由Dixon和Mood于1948年首次提出,1985年Bruce进行了改进。该方法最大的特点是大大减少实验动物的使用,不但可以进行毒性表现的观察,还可以估算LD50及其可信限,适合于能引起动物快速死亡的受试物。OECD最早于1998年采用UDP,期间几经更新并于2006年更新列为指南TG 425。2008年我国采用该方法为国家标准(GB/T 21826-2008)
原理:UDP由限度试验和主试验组成,限度试验分为2000mg/kg和5000mg/kg两个剂量水平,用于受试物毒性可能较小的情况,两种剂量限度试验过程有细微差别,但最多仅用5只动物。主试验是一个预先设计的染毒程序,每次染毒1只动物,由第1只动物染毒后的反应决定第2个动物接受化学物的剂量,若动物存活,第2只动物给予高一级剂量,若第1只动物死亡或出现濒死状态,则第2只动物给予低一级剂量。在对每只染毒动物仔细观察48h后,可以决定是否对下1只动物染毒以及确定染毒剂量。当满足停止试验的标准时可以结束试验。根据终止时所有动物的状态,用最大可能性法计算LD50值。实验需要选择一个比较合适的剂量范围,使得大部分的动物所接受的化学物剂量都会在真正的平均致死剂量左右。如果剂量范围过大,则需要有更多的动物来进行观察。采用上下增减剂量法确定LD50只需要6-9只动物。
UDP最大的优点是根据数据可以使用最大相似法计算LD50的值,以及LD50的置信限。但是置信限的计算是假设参数σ(标准差)已知的基础上计算的,σ是概率比log10剂量线斜率的倒数。有文献报道相似物质的σ可通用。对于斜率较陡的高毒性化合物而言,这个推断对LD50的估计不会产生影响,但是这种标准误的估计会受影响,也可能变得不可靠。如果使用多个剂量水平,那么就可以获得剂量反应的相关信息,但是精确剂量反应却不取决于已公布的过程,因为默认假设通常为σ=0.12。不管采用何种统计方法,UDP方法比经典LD50实验使用的动物数量要少。美国EPA开发了上下增减剂量法的统汁学软件(AOT 425StatPgm),只需将每次的染毒剂量及动物情况输入程序,程序会自动给出试验的终点剂量,并计算LD50及95%可信限。
二、三种优化方法的比较
尽管这三种实验方法的技术路径不同,但出发点均是为了减少动物的实验,减轻动物的痛苦,且较原经典的LD50实验方法(OECD TG 401)使用的动物数量大大减少(表1):
表 急性经口毒性试验的优化方法比较
 
FDP
ATC
UDP
每次使用动物数量
5-7只
平均7只
6-9只
每次试验动物死亡数量
1只
2-3只
2-3只
是否为观察研究
是否以动物死亡为终点
剂量水平(mg/kg)
5,50,300,2000 (5000)
5,50,300,2000(5000)
2000 ~5000
每剂量水平使用小鼠数
5只
3只
1只
目标
确认导致明确毒性的最低剂量水平
确认导致死亡的最低剂量
估计LD50的值
是否可以得到精确LD50
全部试验所需动物数
14.8
12
6-10
从表中可看出,三种方法都能有效的减少实验动物的使用和实验动物的死亡数量,但每种方法之间有一定的差别。
三种方法每次使用动物数量差别不大,但每次试验动物死亡数量则是FDP较少。FDP是以毒性发展的临床体征的观察作为终点,这种方法易受主观影响,这就需要较为详细的体征标准来判定是否进入下一步实验,而ATC与UDP的判定标准较为确定。FDP和ATC的剂量水平较为固定,而UDP的剂量水平则是通过前一剂量水平动物的反应和剂量级数因子对下一剂量水平进行估计。从全部试验所需动物数来看,UDP是使用动物最少的一种替代方法。
3种方法均需预设剂量,开始剂量的确定可基于小范围内的预试验研究、细胞毒性筛选或已有资料进行分析。染毒后,观察动物明显的毒性症状,包括死亡(ATC或UDP),或基于证据的毒性(FDP)。
由于FDP为直接观察实验动物染毒后情况,故其能够为危险评价提供毒性的表象,包括:性质,发作时间,过程和最终结果。并且,FDP有较佳的实验室间的重复性[3]。对于ATC而言,实验是以实验动物的死亡作为终点,但其使用动物数量大大减少,这得益于其动物的使用是基于对上一只实验动物的情况来判断的。并且ATC是建立在线性回归模型的基础上,在国内和国际间环状研究之前基于生物学基础上进行了评估,结果显示,验证研究中ATC在毒性的分类和动物特征的生物识别和观察有良好的表现[8]。据Schlede报导,欧洲约50%的经口毒性试验采用的是ATC法。
   UDP能够直接提供目前急性经口毒性危害分类系统数据,包括LD50及其置信限,以及死亡剂量反应关系曲线斜率及其置信限,而这些是FDP和ATC不能提供的。但是UDP不适用于有迟发性毒性反应特点的物质[9]。而在FDP和ATC试验中,如出现迟发性死亡只要求另外降低剂量水平或重新研究即可。
  三、应用前景与展望
    在毒性测试中,无论是FDP的不以动物死亡为终点,还是ATC中每批剂量的两阶段实验过程均可以减少实验动物的使用,而且能进行物质的分类。基于这些发现,它揭示了新的实验方法应结合剂量水平和ATC实验方法的过程和FDP的终点,那么这个方法较FDP或ATC会更加有效。
    以上方法虽然有效地减少了实验动物的使用数量,但是终究还是需要付出动物生命的代价。下一步,应致力于开发完全不使用动物的替代方法,按照CVAM提出的急性毒性评价的试验策略,受试物应按以下5步法顺序进行评价[11]:(Q)SAR和体外检测((Q)SAR → 细胞毒性试验→ 代谢的计算机模型→ 生物转化检测→ 细胞特异性毒性试验,如果每一步测试则该物质都分类为“高毒”,则该物质的分类就此确定,试验即可中止。如果所有的前面所述实验的评价结果都表明该物质“不是非常毒”,才需要进行有限的体内实验。根据这一设想,目前已有多项体外细胞试验的组合用于急性毒性的预测,有的方法已经过严格的验证。充分运用这些细胞检测方法,结合上述标准化的优化方法,可进一步减少动物的使用[1]
 
参考文献
    1.程树军,焦红.实验动物替代方法原理与应用,北京:科学出版社,2010
    2.Stallard N, Whitehead A, Indans I. Statistical evaluation of an acute dermal toxicity test using the dermal fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol.2004, 23, 405-412.
    3 Botham PA.Acute systemic toxicity—prospects for tiered testing strategies. Toxicology in Vitro,2004,18:227-230
     余略
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